个人信息

姓名：支正飞

导师：乔杰教授

邮箱: [email protected]

实验室地址：北京市海淀区北京大学第三医院生殖医学中心

个人研究方向：异质性基因在胚胎发育过程中对细胞命运决定的影响

研究背景：小鼠胚胎发育谱系分化

小鼠的胚胎发育从形成受精卵开始，经过卵裂逐渐形成二细胞、四细胞、八细胞、桑椹胚和囊胚。一般来说，小鼠第一次卵裂在受精后18～24h；以后每隔12h左右分裂一次。小鼠胚胎卵裂到8细胞阶段时开始致密化，致密化的细胞分裂后，形成16细胞的桑椹胚，在桑椹胚阶段，胚胎由输卵管进入子宫。在16～32细胞期出现小的囊腔而进入囊胚期。囊胚期可分为四个阶段：16～32细胞期，囊胚腔很小，不易看见，为早期囊胚；有完整的囊胚腔，并能明显区分为内细胞团时为晚期囊胚；囊腔的体积进一步扩大，镜下像一个水泡，内细胞团相对较小的时期为扩张囊胚；扩张囊胚从透明带孵出后则为孵出囊胚，这时透明带并非溶解，而是由于子宫内及滋养层的一些酶使一部分透明带软化，囊胚细胞由软化部位钻出，孵化期的时龄约为96～110h。小鼠胚胎各阶段卵裂球的发育时间如下表所示（小鼠胚胎发育时间表），小鼠胚胎发育各阶段示意图如下图所示（小鼠胚胎发育模式图）。

小鼠胚胎发育模式图

小鼠胚胎发育时间表

在小鼠胚胎发育的过程中有很多关键事件。在二细胞期，胚胎发生合子基因组激活（zygotic genome activation，ZGA）。因为刚受精的胚胎存在全基因组沉默的现象，所以受精卵激活自身基因组是个体生命中的第一次转录事件。之后子代逐渐脱离对母源因子的依赖，并在特定的发育时间点激活自身基因组来启动胚胎发育程序。在八细胞期，卵裂球开始发生致密化，卵裂球变得扁平，彼此之间的接触增加，细胞的全能性开始逐渐向多能性转变，形成桑椹胚。体内发育的胚胎在桑椹胚阶段会由输卵管进入子宫。十六细胞期时，小鼠胚胎会有两种截然不同的细胞系出现：内细胞团（inner cell mass, ICM）和滋养外胚层（trophectoderm, TE）。排列在胚胎内的细胞产生内细胞团，而外层的细胞产生滋养外胚层，形成小的囊胚腔，此时的囊胚腔很小，不易看见，为早期囊胚；直到晚期囊胚阶段，出现明显完整的囊胚腔和内细胞团。内细胞团中又有一些细胞分化成上胚层细胞（epiblast, EPI），剩下的细胞分化成胚外原始内胚层细胞（extraembryonic primitive endoderm, PE）。TE细胞最终会发育成胚胎的附加结构，如胎盘，它是母体为胚胎提供营养的通道。EPI细胞最终会发育成胚胎，PE细胞最终会发育成卵黄囊，该过程即哺乳动物胚胎中不同的细胞命运分化。研究显示，有不同的分化命运的细胞在转录组、蛋白质组、翻译组等层面上有一定的异质性，即倾向于分化成ICM细胞中的基因表达与倾向分化成TE细胞中的基因表达是不同的，因此，在单细胞分辨率上研究哺乳动物胚胎发育过程中的异质性可以为解释分化过程发生的机制提供机制。有研究表明，通过分析单细胞的分子异质性，我们可以在四细胞到八细胞阶段预测哪些细胞更有可能分化成ICM细胞或TE细胞。然而目前我们对哺乳动物胚胎发育的理解仍然有许多未知，仍亟待解决。ICM细胞和TE细胞有其特定的分子标志物。例如，ICM细胞的分子标志物是Nanog、Oct4和Sox2等；而TE细胞的分子标志物则一般是Cdx2和Gata3等。ICM细胞和TE细胞的分子标志物介绍如下表所示。

ICM标志物及其主要功能

TE标志物及其主要功能

已有的异质性基因研究

Sox21

有研究团队利用了植入前小鼠胚胎单细胞转录组测序技术，找到了植入前胚胎内单细胞间的转录组异质性。作者根据植入前胚胎内单细胞的转录组数据确认了二细胞期、四细胞期、八细胞期、十六细胞期和三十二细胞期间基因的差异表达，作者发现四细胞期到八细胞期的过程是转录变化最多的时期。同时，二细胞和四细胞期的胚胎间基因表达差异比胚胎内更大，而八细胞期却没有明显差别。这说明从四细胞期到八细胞期胚胎内异质性程度相对来说越来越高。修正胚胎间表达水平的差异后，作者找到了在二细胞期、四细胞期和八细胞期同一个胚胎内的异质性基因。研究发现，二细胞期、四细胞期和八细胞期胚胎分别有659、1339和813个高度异质性基因，发现四细胞期的高度异质性基因最多。作者最后认定四细胞期的胚胎高度异质性基因具有研究价值，因为这个阶段的细胞展示出了不同的分化命运和潜能。作者锁定了一个在四细胞期的所有胚胎中最高度异质性的基因之一——编码转录因子的Sox21。Sox21的表达直接被Sox2控制，并且它的调控区域被Oct4结合。作者通过注射siRNA抑制合子期或二细胞期的小鼠胚胎中Sox21的表达以研究Sox21对小鼠胚胎植入前发育过程的影响。研究发现，Sox21表达量的降低更容易产生滋养外胚层的子代细胞，并且会导致TE细胞的标志物——Cdx2的提前与上升表达。这个结果说明Sox21可能对维持细胞的多能性方面发挥了重要的作用。

Tfap2c和Tead4

在小鼠胚胎植入前发育期间，建立顶-底细胞极性是从全能性过渡到多能性的关键，这诱导细胞分化为滋养外胚层细胞。在小鼠胚胎中，这一事件发生在八细胞阶段，这个时机遵循一个与胚胎大小或细胞周期进展无关的内在发育时钟。尽管顶域形成很重要，但在小鼠和人类胚胎中建立细胞极化和这一事件的时间调节的分子机制在很大程度上仍然难以捉摸。于是有研究人员开始研究小鼠胚胎极化的分子机制。

作者首先根据已发表的单细胞测序数据找到了118个细胞骨架极性调节基因和6个转录因子的基因，然后通过RNA干扰（RNAi）在不同胚胎中分别下调这些基因的表达，最后发现抑制转录因子Tfap2c和Tead4的表达可以防止胚胎极化。

作者接着通过向合子期的胚胎注射Tfap2c和Tead4的sgRNA敲除胚胎中的Tfap2c和Tead4基因。同时敲除Tfap2c和Tead4会导致胚胎不发生极化。这说明这两个基因对极化过程非常重要。

作者再通过在二细胞后期向胚胎注射mRNA的方式提高Tfap2c和Tead4在胚胎中的表达，观察提高这两个基因的表达是否会导致极化现象提前。研究发现，提高Tead4的表达不会导致胚胎的提前极化，而提高Tfap2c的表达会导致胚胎在四细胞期形成富含极性蛋白的细胞突起。同时提高Tfap2c和Tead4的表达会导致细胞突起的提前出现。然而，这种突起比自然形成的八细胞顶端结构域要小。因此，作者找到了两个与胚胎极化相关的基因，同时确定形成正常的顶端结构域还需要其它的因素。

作者前面发现，蛋白激酶C-Rho鸟苷三磷酸酶（GTPase）信号通路引起的肌动球朊激活对于顶端结构域的形成是必要但不充分的。因此，作者假设，除了Tfap2c和Tead4以外，可能需要激活Rho GTPase才能完全实现极化。作者在二细胞阶段注射了Tfap2c和Tead4的mRNA，并在四细胞阶段为组成型的有活性的Ras同源家族成员A（RhoA）-Q63L（Gln63→Leu）的mRNA。这三个因素的提前表达导致小鼠胚胎在四细胞阶段建立了完整的顶端结构域。这些诱导的顶端结构域富含ezrin和Pard6，与通常仅在八细胞阶段形成的根部结构域非常相似。这说明Tfap2c、Tead4和RhoA共同过表达可以使小鼠胚胎极化现象提前出现。

接着，作者开始探究Tfap2c、Tead4和RhoA-Q63L在四细胞期诱导的细胞极化是否可以对细胞分化过程也产生影响。作者推测，继承了细胞顶端结构域的细胞更有可能分化成TE细胞。结果显示，提前极化确实会导致细胞自主提前表达TE细胞的转录因子Cdx2和Gata3。因此，Tfap2c、Tead4和RhoA-Q63L的联合表达不仅足以推进极化的时机，也足以推进分化过程。

LincGET

长链非编码RNA（lncRNA）近年来被发现是许多重要生物学事件的关键调控因子，包括控制干细胞的多能性和分化。然而，目前尚不清楚lncRNA是否也积极参与了早期胚胎细胞命运决定过程，例如首次谱系分化——即将全能性的合子分化为内细胞团（ICM）和滋养外胚层（TE）的过程。内细胞团最终形成胎儿，而滋养外胚层则发育为胎盘。

作者通过在二细胞期过表达和抑制LincGET的表达发现，LincGET的缺失可以促进卵裂球向TE分化。接着，作者通过RNA pull down、Co-IP等实验发现LincGET可以特异性地与CARM1结合并且促进了CARM1的核定位，CARM1进一步可以提高组蛋白H3第26位精氨酸（H3R26）甲基化水平（H3R26me），激活ICM特异性基因的表达，上调转座子表达，并增强全基因组染色质的可及性。当同时过表达LincGET并敲低Carm1时，胚胎的命运不再偏向某一方向，说明LincGET在引导ICM谱系形成中的作用依赖于CARM1。因此，我们的研究结果表明，LincGET是目前已知最早能够偏向哺乳动物2细胞胚胎细胞命运的谱系调控因子之一。

研究思路

前期，通过分析小鼠早期胚胎的转录组数据，我们发现在四细胞胚胎阶段存在1000多个显著异质表达的基因，在这其中也包括已被报道的Sox21。本课题拟从上述研究发现的1000多个异质表达基因中，选择可能参与建立ICM特异转录调控网络的基因A，以探索其在植入前胚胎发育命运决定中作用及机制。

研究设计

实验室代表成果

数据库

胚胎发育数据库DevOmics

配子发生数据库GametesOmics

代表性论文